Identificación de leptospiras recuperadas a partir de ecosistemas acuáticos del noreste de La Pampa utilizando una técnica de qPCR para cepas patógenas

Abstract

La leptospirosis es una enfermedad considerada una zoonosis de gran distribución en el mundo, la cual se adquiere por transmisión directa e indirecta a través de la orina de animales silvestres y domésticos infectados con espiroquetas del género Leptospira. Aunque las actividades asociadas con las ocupaciones rurales son factores de riesgo significativos, el contacto prolongado con el agua en las inundaciones es el riesgo individual más importante en nuestro país. Nuestra región es un área climática propensa a ellas por precipitaciones abundantes, aunque el desvío porcentual de precipitaciones varia año a año. La asociación entre el contacto con el agua ambiental y el riesgo de infección en climas templados no está totalmente claro. Los problemas de diagnóstico y la falta de un monitoreo sistemático y adecuado de la leptospirosis pueden dar como resultado un conocimiento incompleto sobre su prevalencia y subestimación del riesgo real relacionado con su propagación. Tampoco se conoce el verdadero rol que cumplen las especies de leptospiras intermedias en los animales y el hombre, un grupo transicional entre las especies patógenas y saprófitas, poco estudiadas en nuestro país. El objetivo de nuestro trabajo es determinar la presencia de leptospiras en aguas ambientales de la región noreste de la provincia de La Pampa e identificarlas a nivel de especie. En este trabajo se presentan los primeros resultados obtenidos. Se procesaron 37 muestras de agua recolectadas de canales pluviales y humedales luego de precipitaciones, durante el periodo de septiembre de 2021 a marzo de 2022. Los puntos de muestreo fueron geolocalizados. Se prefiltraron 500 mL de cada muestra utilizando papel de filtro Whatman Nº1. Posteriormente se filtraron a través de una membrana estéril de 0,22 μm de diámetro de poro. Un mililitro de agua filtrada se inoculó en medio Fletcher, preparados en nuestro laboratorio, adicionados con 5-fluorouracilo (200 µg/mL). Los tubos sembrados se incubaron a 28-30 °C durante 180 días, observándolos semanalmente mediante microscopía de campo oscuro. A partir de cada cultivo presuntivo positivo se realizó la extracción de ADN utilizando un kit (ADN Puriprep S-kit, Inbio Highway, Bs.As.,Argentina) según las indicaciones del fabricante. El DNA de cada cepa se conservó a -20 ºC hasta su procesamiento. Para la detección de Leptospira patógenas, se realizó un ensayo de PCR en tiempo real que detecta la presencia del gen lipL32 el cual no está presente en especies no patógenas. Se utilizaron los primers LipL32F: 5´-AGAGGTCTTTACAGAATTTCTTTCACTACCT-3´y LipL32R: 5´-TGGGAAAAGCAGACCAACAGA-3`. El protocolo de amplificación consistió en 1 ciclo de 3 min a 95 °C seguido de 39 ciclos de amplificación (30 s a 95 °C, 13 s  60 °C, 11s a 72ºC). Se utilizaron como controles positivos 6 cepas de referencia. En el 16,3% de las muestras se observaron espiroquetas compatibles con leptospiras, 40% (4/10) de las mismas correspondieron a canales pluviales y 7,4% (2/ 27) a humedales. Ninguna de las espiroquetas recuperadas fue detectada como leptospiras patógenas. Para confirmar si son Leptospira se debe realizar un ensayo de PCR convencional específico de género dirigido al gen rrs y su posterior secuenciación para la identificación final.