Introducción

Durante muchos años el objetivo de selección en las explotaciones lecheras estuvo focalizado en las altas producciones por su importancia económica. Sin embargo, las producciones altas traen consecuencias en la salud y gastos en cuidados veterinarios. Los rasgos de salud generalmente tienen heredabilidad baja y cantidades limitadas de datos, lo que dificulta el potencial de mejora genética por métodos tradicionales de selección ⁽¹⁾.

La mastitis bovina es considerada una enfermedad con elevada incidencia que afecta mundialmente la industria láctea, pues ocasiona pérdidas económicas importantes a los productores de leche debido a la disminución de la calidad y cantidad de leche producida y a un aumento en los costos por tratamiento, servicios veterinarios y pérdida de animales (2). Esta enfermedad infecciosa se caracteriza por anormalidades visibles en la ubre o en la leche. La glándula se inflama y se acumulan glóbulos blancos en la leche, que junto a las células epiteliales del tejido productor de leche, constituyen lo que se conoce como células somáticas. Las vacas con altos registros de células somáticas producen leche con menos grasa y proteína, en particular caseína. Por lo tanto, disminuye la calidad de los productos lácteos derivados. Los conteos de células somáticas (CCS) en la leche se utilizan como indicadores de la salud mamaria sobre la base de que reflejan una respuesta inmunitaria y, por lo tanto, la presencia de infección. ⁽³⁾

La mastitis subclínica se caracteriza por la presencia de microorganismos, un conteo elevado de células somáticas en la leche y no tener tratamiento ⁽⁴⁾. A diferencia de la mastitis clínica, en este caso no existen alteraciones obvias en la ubre ⁽⁵⁾. No obstante, sí ocurren cambios en la composición de la leche a causa de las bacterias y componentes inflamatorios ⁽⁶⁾.

La necesidad de una mayor eficiencia en el proceso industrial de la leche y la creciente demanda del mercado por productos de mayor calidad traen como consecuencia un incremento en las exigencias de los estándares de la materia prima. Habitualmente se hace referencia a un precio pagado por litro de leche producido y en realidad el mismo surge de la conjunción de diferentes parámetros, uno de los cuales está referido a la calidad sanitaria de la leche, valorado a través del registro de células somáticas presentes. Si la calidad de la leche no es buena hay pérdidas económicas ⁽⁷⁾ ya que se afecta el rendimiento del queso y la vida útil de todos los productos lácteos ^{(8, 9 )}.

Es por ésta razón que desde hace varios años existe interés, no sólo en seleccionar a favor de una alta producción y calidad lechera (litros de leche, cantidad y porcentaje de grasa y proteínas), sino también en seleccionar a favor de un bajo CCS.

Una posible solución es identificar loci de rasgos cuantitativos que controlan rasgos sanitarios, como marcadores genéticos y facilitar la selección para mejorar sanidad y aptitud en las vacas lecheras y así seleccionar animales resistentes a enfermedades infecciosas.

La variabilidad genética de la resistencia a la mastitis está detectada en el ganado lechero. Muchos estudios se centraron en la variación poligénica del rasgo, al estimar la heredabilidad y la correlación genética entre los rasgos fenotípicos relacionados con la mastitis, tales como los recuentos de células somáticas y los casos clínicos ⁽¹⁰⁾.

La variación en el resultado de la infección depende en gran medida de las diferencias en la constitución genética de los individuos. Los factores que pueden influenciar el resultado de la infección son varios y se clasifican en: variables ambientales; variables propias del patógeno y factores del hospedador ⁽¹¹⁾. Generalmente, las variables ambientales en la resistencia/susceptibilidad a enfermedades infecciosas tienen un efecto considerable, por lo que estos caracteres presentan una mediana a baja heredabilidad.

Aquellas variables derivadas del patógeno, implican factores de virulencia que pueden incrementar o atenuar la habilidad de colonización del organismo, o aumentar la patogenicidad a través de la expresión de una toxina. Finalmente, los factores atribuidos al hospedador implican principalmente la dotación genética del organismo dado que en toda población existen diferencias individuales en la resistencia/susceptibilidad a enfermedades infecciosas ⁽¹¹⁾.

Los loci del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) constituyen los principales genes candidatos para el estudio de asociación entre marcadores genéticos y resistencia/susceptibilidad a enfermedades infecciosas.

Cada uno de sus genes a su vez tiene muchos alelos por lo que es también polimórfico. Este polimorfismo tiene un profundo efecto en el reconocimiento de los antígenos por las células T y la combinación de poligenia y polimorfismo extiende ampliamente el rango de péptidos que pueden ser presentados a las células T por un individuo ⁽¹²⁾.

En bovinos el MHC se denomina Bovine Leukocyte Antigen (BoLA) y ha sido mapeado en el autosoma bovino 23 (BTA 23) dentro de una extensión de 4.000 Kb que contiene más de 154 genes estrechamente ligados ^(13). Está estructurado en moléculas de Clase I, II y III. Las analizadas en este estudio son las moléculas de clase II, compuestas de un locus DRA y al menos 3 loci DRB. Entre estos loci, el gen DRB3 es altamente polimórfico y en particular el exón 2 (BoLA-DRB3.2) de dicho gen codifica muchos rasgos relacionados con la inmunidad a enfermedades ⁽¹⁴⁾.

En vacas lecheras los polimorfismos de estas moléculas se han asociado con resistencia/susceptibilidad a enfermedades infecciosas tales como mastitis clínica, leucosis, herpes virus 1 (Bo-HV1) y neosporosis entre otras (15-20). Sin embargo, es poco el avance de las investigaciones para conocer si los loci específicos del BoLA de clase II están individualmente asociados con bajos y altos CCS, como medida de resistencia/susceptibilidad, o si otros genes ligados son responsables de dicha asociación.

Por lo tanto, el objetivo fue analizar los polimorfismos en el locus de Clase II BoLA-DRB3.2 y asociarla con rasgos de producción lechera y CCS en ganado Holstein de La Pampa.

Los objetivos específicos fueron:

a) Caracterizar los polimorfismos presentes en el locus de Clase II BoLA-DRB3.2 en la población en estudio.

b) Analizar la asociación entre el CCS y los alelos del locus de Clase II BoLA-DRB3.2.

c) Asociar datos de producción de litros de leche, porcentaje de grasa y proteína y los alelos del locus de Clase II BoLA-DRB3.2.

Materiales y Métodos

Los animales estudiados pertenecen a un tambo de la zona aledaña a General Pico, departamento Maracó, La Pampa. Se tomaron muestras de 5 ml de sangre a 157 vacas lecheras de la raza Holstein. Dichas muestras se conservaron con EDTA a -20 °C hasta su utilización.

De los animales muestreados se obtuvieron registros promedios mensuales de conteo de células somáticas y registros de producción tales como litros de leche, porcentaje de grasa y porcentaje de proteína durante un periodo de cuatro años.

Diseño experimental

El registro de CCS se transformó a una variable dicotómica de 0 y 1. Representado 0 en el caso de aquellos individuos que poseían menos de 250.000 células somáticas por mililitro leche y por 1 a aquellos que superaban dicho valor (CCS ≥ 250.000 cel/ml), (NMC Global Milk Quality http://www.nmconline.org). Cada registro de producción de leche, porcentaje de grasa y porcentaje de proteína es el promedio mensual de ese rasgo productivo. Estos datos se relevaron mensualmente durante un lapso de tiempo de 4 años y el total de lecturas de cada animal varió entre 10 y 30.

Extracción de ADN

El ADN genómico se extrajo a partir de las muestras de sangre entera mediante el kit comercial de HIGHWAY (ADN Puri Prep-S Kit). El ADN genómico extraído se analizó en geles de agarosa. Se tomaron 3 ul de cada muestra y se mezclaron con 3 ul de colorante. La electroforesis se realizó a 100 voltios durante 30 minutos. Los geles se sumergieron en un baño con bromuro de etidio durante 10 minutos y se observaron en transiluminador de emisión de luz ultravioleta (UV).

Tipificación del exón 2 del gen BoLA-DRB3.2 mediante PCR-RFLP

La caracterización de los alelos del locus BoLA-DRB3 fue llevada a cabo por el método de PCR anidado-RFLP descrito por van Eijk et al. ⁽²¹⁾. Dicha técnica consiste en la amplificación de una secuencia de ADN de 284 pb del exón 2 del gen BoLA-DRB3 y la posterior digestión de los productos de PCR con las enzimas de restricción Rsa I, Bsty I y Hae III. La clasificación de los alelos se realizó teniendo en cuenta las combinaciones de los patrones de restricción obtenidos en forma independiente para las enzimas antes mencionadas.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

En la primera ronda de amplificación se utilizaron los cebadores HL030 (5´-ATCCTCCTCTCTGCAGCACATTTCC-3´) y HL031 (5´-TTTAAATTCGCGCTCACC TCGCC GCT-3´). El programa utilizado en la reacción de PCR consistió en 4 minutos a 94° C de desnaturalización inicial, 9 ciclos de 1 minuto a 94°C, 2 minutos a 60° C y 1 minuto a 72°C, seguidos por 4 minutos de polimerización final a 72ºC.

En la segunda etapa se usaron los cebadores HL030 y HL032 (5´- TCGCCGCTGCACAGTGAAACTCT -3´) (Lewin et al. 1992). El programa consistió en: una etapa de desnaturalización de 1 minuto a 94°C seguida de 19 ciclos de 1 minuto a 94°C, 30 segundos a 65°C y 1 minuto a 72° C, seguidos por 4 minutos de polimerización final a 72ºC.

Polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP)

Alícuotas del producto de amplificación (12 µl) se digirieron por separado con las enzimas de restricción Rsa I, Hae III y Bsty I (5 U) durante 3 horas, de acuerdo con las indicaciones del proveedor (Promega, Madison, WI; New England Biolabs, Beverly, MA, USA). Las temperaturas de digestión fueron de 37°C para las dos primeras enzimas y de 60°C para la tercera. Los fragmentos de restricción se resolvieron en geles de poliacrilamida 8% que se utilizaron para separar las bandas de los productos de la digestión enzimática (PCR-RFLP). Los geles se tiñeron con nitrato de plata.

Análisis estadístico

Se utilizó un modelo lineal generalizado para el análisis de asociación entre la variable respuesta como rasgo productivo y los alelos. Se tuvieron en cuenta los efectos fijos como la estación del año y el año de registro y alelos BoLA, además, se consideraron los efectos aleatorios de cada animal como son la producción, el porcentaje de grasa y el porcentaje de proteínas. La variable respuesta será uno de los rasgos productivos; la producción de leche, el porcentaje de grasa y el porcentaje de proteína. Este rasgo productivo estará asociado a un promedio general de dicho rasgo, al efecto fijo de la estación, al efecto fijo del año, al efecto aleatorio animal sobre el rasgo analizado con media 0 y varianza igual a la covarianza entre mediciones repetidas dentro de cada animal y a un error con media 0 y varianza σ2.

Para analizar el CCS se transformó la variable a una variable dicotómica, tomando el valor 1 para el caso en que el CCS> 250.000cel/ml (mastitis subclínica) y tomando el valor 0 para el caso en que el CCS< 250.000cel/ml. Esta variable dicotómica se analizó mediante un modelo de regresión logística cuya función de enlace relaciona el valor esperado con el predictor lineal (ƞi) y viene expresada mediante la siguiente ecuación log(πi / (1 - πi)) = ƞi. El valor del predictor lineal es la probabilidad de ocurrencia de la mastitis subclínica asociado a una media general y los demás efectos que fueron considerados en el modelo anterior de los rasgos productivos. Se menciona que el modelo se ajustó en función del criterio de Akaike (1974).

En ambos modelos se utilizó el software InfoStat el cual incluye librerías del software R para la resolución de los problemas.

Resultados

En la población en estudio se caracterizaron los polimorfismos presentes en el exón 2 del gen BoLA-DRB3 por PCR-RFLP y se identificaron un total de 32 alelos distintos, en un muestreo de 157 vacas. Los alelos de mayor frecuencia hallados son el alelo DRB3.*23, *24, *16, *25, *28 y *22, todos tuvieron una frecuencia absoluta mayor o igual a 20, tal como se muestra en la Tabla N° 1.

Tabla N° 1

Los resultados de la asociación entre el conteo de células somáticas y alelos indicaron efectos significativos en la asociación (p= 0,03). El modelo planteado permitió hallar las probabilidades que resultan de aplicar la transformación inversa de la función enlace del modelo de regresión logística. A su vez, los Odds Ratio se calculan por OR=ePredLin. La prueba LSD Fisher evidenció diferencias entre los alelos.

La Tabla N° 2 muestra estos resultados y además el correspondiente intervalo de confianza del 95% para los Odds Ratio. Estas diferencias en el CCS muestra a los alelos BoLA-DRB3.2*23, *28, *22 y *16 identificados con la letra A con incidencia estimada de (altos conteos de células somáticas) entre el 38% y el 43% de probabilidad de tener mastitis subclínica y cuyos OR varían entre 0,61 y 0,74. Los alelos identificados con la letra B son BoLA-DRB3.2*28, *22, *16 y *24, los tres primeros también se encuentran identificados con A, con incidencias estimadas entre el 30% y el 42% y sus OR entre 0,42 y 0,71. Y por último identificados con la letra C los alelos BoLA-DRB3.2*24 y *25 con incidencia del 30% y 21% son los alelos que poseen la menor probabilidad de poseer mastitis subclínica y cuyos OR son 0,42 y 0,26.

Tabla N° 2:
Resultados de la Prueba de LSD Fisher en el modelo de CCS. Referencia: Letras distintas indican diferencias significativas (p<0,05).

De los rasgos productivos analizados y su error estándar se obtuvieron estos valores promedios, para la producción 19,49 litros (0,16 litros), para el porcentaje de grasa 4,03% (0,02%) y para el porcentaje de proteína 3,54% (0,10%).

Del modelo planteado se observó una asociación entre los alelos con la producción de leche (p= 0,0132) y no se encontró asociación significativa con el porcentaje de proteína y de grasa.

La Tabla N° 3 muestra las estimaciones de producción promedio de leche y su correspondiente error estándar para cada alelo analizado. Se diferencian los niveles de producción identificados con la letra A, B y C. Mostrando que los alelos BoLA-DRB3.2*24 y BoLA-DRB3.2*25 identificados con la letra A tienen el mayor nivel de producción promedio de leche, mientras que los alelos BoLA-DRB3.2*16, BoLA-DRB3.2*22 y BoLA-DRB3.2*28 identificados con la letra C tienen el menor nivel de producción promedio de leche.

Tabla N° 3:

Discusión

En el presente trabajo se caracterizaron los polimorfismos presentes en el exón 2 del gen BoLA-DRB3 en una población de bovinos de raza Holstein de la provincia de La Pampa y su asociación con CCS y rasgos de producción de leche. El exón 2 es altamente polimórfico y es reconocido por su rol en la resistencia/susceptibilidad a enfermedades infecciosas y autoinmunes ⁽²²⁾. Por este motivo han sido llevados a cabo numerosos estudios en diferentes razas bovinas, tanto criollas como comerciales, utilizando diferentes metodologías ^{(14, 23-30, 31, 32)}.

En nuestro estudio los resultados obtenidos también evidenciaron un elevado polimorfismo en dicho gen, detectando un total de 32 alelos. Todas las variantes encontradas habían sido reportadas previamente. Dicha coincidencia de diversidad alélica de las diferentes razas bovinas sigue manifestándose a pesar de la alta presión de selección sufrida por la raza Holstein y el alto nivel de consanguinidad ^{(29, 22, 26).}

Los alelos de mayor frecuencia (n≥ 20) hallados son el alelo BoLA-DRB3.*23, *24, *16, *25, *28 y *22, en coincidencia parcial con lo reportado por Pokorska et al. (28) quienes detectaron que el alelo BoLA-DRB3 *24, *22 y *16 eran los más frecuentes en su estudio. Estos resultados podrían ser consecuencia del alto nivel de homogeneidad exhibido por esta raza debido al uso de la misma genética a nivel global ⁽²⁹⁾ .

Asociación entre los alelos del locus BoLA-DRB3 y CCS

Numerosos estudios han analizado la asociación entre los alelos del gen BoLA-DRB3 y la susceptibilidad/resistencia a varias enfermedades infecciosas, focalizándose principalmente en mastitis, leucosis bovina y dermatofilosis, entre otras ^{(14, 16-19, 23, 25, 30)} .

De acuerdo a los resultados obtenidos en el presente trabajo se detectó que el alelo BoLA-DRB3.2*23 estaba asociado con alto conteo de células somáticas CCS (p=0,03), siendo considerados dentro de este grupo aquellos animales que habían desarrollado mastitis o bien poseían ≥250.000 cel/ml. Este resultado es coincidente con lo reportado por Shariff et al. (30) Rupp et al. ⁽³²⁾ y Oprzadek et al. (33). En tanto, Yoshida et al. ⁽²²⁾, Baltian et al. ⁽¹⁶⁾, Zambrano et al. ⁽³⁵⁾ y Dietz et al. ⁽¹⁴⁾ en oposición a lo mencionado, lo encontraron asociado con resistencia a mastitis.

En este estudio el alelo DRB3.2*28, que poseía una frecuencia considerable para estudiarlo, se lo encontró en el grupo de mayor CCS y de menor producción lechera. En tanto que Suprovych et al. (26) y Oprzadek et al. ⁽³³⁾ asociaron al alelo DRB3.2*28, a un bajo conteo de células somáticas..

En nuestro estudio el alelo DRB3.2*16 pertenece al mismo grupo que el alelo *23 (Tabla N°2) se encontró asociado con mayor CCS al igual que Baltian et al. (16), Dietz et al. (14) y Yoshida et al. (22, 37) quienes reportaron que el BoLA DRB3.2*16 se asociaba con elevado CCS y determinaron que el mismo actuaba como factor de riesgo para el incremento agudo y crónico en el CCS en vacas Holstein de segundo parto. Por lo contrario Pokorska et al. ⁽²⁸⁾ , Shariff et al. ⁽³⁰⁾ y Zambrano et al. ^{(35 )} lo asociaron a un bajo riesgo de mastitis clínica. Rupp et al. ⁽³²⁾ no encontraron asociaciones entre el alelo DRB3.2*16 y CCS.

El alelo BoLA-DRB3.2*24 en este trabajo se asoció con disminución del CCS en concordancia con lo propuesto por Rupp et al. ⁽³²⁾ Kulberg et al. ⁽³⁶⁾. Por otro lado, Starkenburg et al. ⁽¹⁾ Shariff et al. ⁽³⁰⁾ y Yoshida et al. ⁽²²⁾ informaron asociación entre el alelo BoLA-DRB3*24 con la enfermedad.

En este estudio el alelo DRB3.2*25 mostró una mayor asociación con bajos conteos de células somáticas (p= 0,03), tal cómo se muestra en la Tabla N°2.

Asociación entre los alelos del locus BoLA-DRB3 y rasgos productivos

Los alelos del BoLA también han sido vinculados con caracteres de producción lechera tales como producción de leche, proteína y grasa en leche ^{(15, 35 , 38)}.

En cuanto a la asociación con rasgos productivos en este estudio se encontró asociación del alelo*25 con una mayor producción de leche. Si bien no se encontró un dato similar en la bibliografía, esta asociación resulta un hallazgo importante. El alelo DRB3.2 *16 está en el grupo de menor producción de leche (p= 0,0132) (Tabla N°3) al igual que lo reportado por Rupp et al.³²).

En este estudio, no se encontró asociación significativa con el porcentaje de proteína en la producción de leche. En tanto que Pashmi et al. (39 ) encontraron que los alelos BoLA-DRB3.2*22 y DRB3.2*24, están asociados a un alto porcentaje de proteína, siendo lo contrario para Shariff et al. ⁽³⁰⁾.

Con respecto al rasgo productivo porcentaje de grasa en la leche, en este trabajo no se encontró asociación significativa, en tanto que Starkenburg et al. ⁽¹⁾ y Pashmi et al. ^{(39 )} encontraron al alelo DRB3.2*22 asociado a un aumento de grasa durante la primera lactancia. El DRB3.2*11 también fue asociado con producción de grasa por Pashmi et al. ^{(39 ).}

Conclusiones

Los resultados en general concuerdan con las frecuencias alélicas de las poblaciones de Holstein estudiadas por otros autores. El alto polimorfismo en el locus estudiado puede tener un efecto significativo en la resistencia a la mastitis.

Los animales portadores del alelo BoLA-DRB3.2*25 se presentan como los más resistentes a la mastitis y con una mayor producción de litros de leche, lo cual es un resultado interesante para nuestro rodeo.

Los estudios de asociación entre los alelos del gen BoLA-DRB3, mastitis y rasgos de producción, se constituyen como una efectiva herramienta para el control de la enfermedad y para seleccionar animales de mayor producción sugiriendo su inclusión en los programas de selección genética.

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Notas

Información adicional

Contribuciones de autor:: Todos los autores contribuyeron a la concepción y el diseño del estudio

Conflictos de intereses:: Los autores declaran por escrito, no tener vínculo o compromiso que condicione lo expresado en el artículo de su autoría y que pueda ser entendido como conflicto de intereses.